众多研究表明，免疫检查位点抑制剂能够改善多种肿瘤治疗后的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）[1]。而肿瘤的微环境特征（TME）通常会与免疫检查点抑制剂的治疗响应有关：比如在TME中PD-L1的表达，会与不同肿瘤类型的抗PD-1/PD-L1疗法的疗效相关[2，3]。另外，TME也有可能会限制效应T细胞对肿瘤细胞的渗入，从而减弱T细胞的扩张，或直接降低浸润淋巴细胞（TILs）的存活力[4]。然而，对于检查点抑制剂是如何介导免疫激活来调节肿瘤的突变分布和影响肿瘤微环境的机理仍然知之甚少。

对此，来自美国纽约纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究团队在2017年11月的Cell杂志上发表的研究成果表明： 基于全外显子测序、转录组测序以及T细胞受体（TCR）测序的多组学联用策略，对68个患有晚期黑色素瘤患者在使用Nivolumab药物（Nivo；抗PD-1药物）前后其基因组信息变化进行了综合性分析。该研究结果揭示了Nivolumab药物的作用机制和肿瘤微环境进化间的关系[5]。

研究亮点

1. 作为一项前瞻性试验揭示了抗PD-1治疗的分子机制；

2. 抗PD-1治疗能诱导肿瘤突变负荷的发生变化；

3. 用药前后肿瘤基因表达模式变化显着并与临床反应相关联；

4. 在免疫检查点阻断之后，T细胞受体数目发生改变。

实验结果

在Nivolumab药物（Nivo）处理前后黑色素瘤的基因组特征的改变

首先，研究人员对68位黑色素瘤患者进行全外显子测序（平均测序深度168X），其中有35位病人曾经使用过ipilimumab（Ipi）进行治疗。可以看到，病人中其突变数目的中位值为183，但在有或无ipilimumab治疗史的患者之间并没有显着差别。另外，根据TCGA数据库定义的用于分析黑色素瘤突变亚克隆结果可知，在有或无ipilimumab治疗史的患者间对Nivolumab药物（Nivo）的反应也并无显着差异。特别地，作者发现肿瘤的突变负荷跟接受过Ipi治疗的患者其治疗后总生存期无关，而在这些接受过Ipi治疗的患者中其肿瘤克隆的突变数目偏低。

随后，作者对接受Nivo治疗的患者作出深入分析，判断使用Nivo药物是否会对肿瘤突变负荷与瘤内异质性产生影响。结果表明，在Nivo药物使用四周后，基因突变数目以及肿瘤抗原数目均发生显着下降（图1）。

随后，作者进一步分析了肿瘤构成的改变与Nivo药物治疗的关系：将样本分为两组，即Nivo药物处理前与处理后。结果发现，在不同响应组之间的肿瘤克隆构成存在明显变化。

Nivolumab药物治疗前后的转录组水平分析

使用RNA-seq对患者肿瘤组织RNA进行表达差异基因分析，发现高表达的基因均为免疫相关基因，暗示着在用药前就存在针对于肿瘤的免疫识别。另外，作者通过GO注释，发现这些高表达基因在T细胞活性增强以及淋巴细胞聚集功能方面存在富集（图3）。

与此同时，作者做出这样的假设：即抗PD-1疗法能够诱导肿瘤转录水平以及整个肿瘤微环境的改变。对此，作者针对性地分析了在Nivo治疗之后，黑色素瘤中基因表达水平的改变。结果显示，475个基因存在显着表达差异，并且这些基因中大多数与免疫调控相关。同时，众多免疫检查位点相关基因的表达也发生上调。而对于发生表达下调的基因，则大多属于肿瘤生长通路上的基因，包括神经黑色素通路、细胞周期调控、有丝分裂以及翻译过程等。另外，作者也观察到了跟治疗相关的一些细胞改变，如CD8+ T细胞和NK细胞数目发生明显增加，而M1型巨噬细胞数目则发生下降（图4）。

黑色素瘤的瘤内T细胞的丰度、活性以及多样性分析

接下来，研究人员想要去了解T细胞在使用Nivo药物之后的动态变化过程， 因此使用了高通量测序技术，针对性地对T细胞受体（TCR）的β链上的互补决定区（CDR3区）进行深度测序。使用的样本为Nivo药物处理前的肿瘤样品以及处理四周后的肿瘤样品。

结果发现，肿瘤浸润性淋巴细胞的比例出现提高，而这与免疫组化的实验结果相一致。与此同时，作者使用了richness，evenness两种多样性评估指数进行样本多样性评价，发现其多样性存在改变。并且，与是否使用过ipilimumab（Ipi）进行治疗有关。另外，为了进一步确定T细胞受体的抗原结合能力，作者紧接着分析了抗体中V基因与J基因的组合类型，结果发现治疗中的非Ipi治疗患者其V、J基因组合的多样性指数要显着降低。以上结果表明：T细胞群体的多样性变化，更多的是由其CDR3区上的氨基酸序列所决定的，即抗原识别特性（图5）。

最后，作者通过评估T细胞群体的分布改变与肿瘤突变克隆的响应，预测新抗原丢失数目与T细胞克隆扩增数目之间的关系。发现T细胞克隆的动态变化跟肿瘤克隆动力学存在关联。此外，作者通过计算新抗原比例发现：抗原突变的产生受到一定的选择压力。以上结果暗示，T细胞能够有效地清除肿瘤细胞表达的新抗原免疫原性（图6）。

总结讨论

研究人员通过将多种组学研究方法相结合的手段，对实施抗PD-1疗法的黑色素瘤患者进行全方位、多维度的肿瘤基因组以及肿瘤微环境改变的深入探究。该研究结果有利于剖析免疫检查位点抑制剂的作用机理，并且为今后免疫检查位点的研究与设计工作打下基础。(生物谷世联博研Bioexcellence）