近年来，结直肠癌（CRC）的高异质性已越来越受到关注。因此，根据独特的肿瘤生物学开发生物标志物，将CRC患者分层到不同的预后及治疗反应亚组是有必要的。

目前已常规应用的标志物如：RAS突变状态用于指导抗EGFR药物治疗、错配修复状态（MMR）指导早期CRC辅助化疗等。分子生物学的发展助力了临床更好地了解CRC、更精确地使用靶向治疗方案，在过去十年中，分子生物学在这方面的成就可概括为三点：

第一，基于对CRC患者基因组的分析，使我们对CRC相关的失调基因有了深入的了解；

第二，基于基因表达谱的分析使将CRC进行预后分层成为可能；

第三，高敏感度的检测分析方法使CRC更广泛的肿瘤内异质性被发现。

核心观点

1、CRC是一种异质性疾病，这种异质性包括肿瘤间与肿瘤内两个水平。通过分子分层，不同亚组的预后及治疗响应均有差异。

2、尽管预后／预测相关的biomarker层出不穷，但可影响临床治疗决策的仅有MSI/MMR、RAS突变和BRAF突变。

3、已报道的基于转录组学对CRC进行的四个分级，其生物学特征、预后均不同，对治疗的响应很可能也不同。

4、国际合作的创新研究设计有助于推动临床个体化治疗的发展。

引言

CRC是一种异质性、分子构成复杂的疾病。重要的是，现已明确要将与临床相关的预后及预测的分子分型信息添加到经典的分期系统（I–IV期）中，这种综合分析对CRC的临床管理正在逐渐变得具体化。

在本文综述中，将讨论对CRC发展的了解以及CRC异质性对疾病诊断和治疗的最新影响。

结直肠癌的发生及发展

CRC的发生是肿瘤生成的一个典型例子。调节细胞增殖、分化和死亡的相关基因突变，为肿瘤细胞提供了生存优势。这些基因的改变使正常组织向腺瘤异常扩张，并且使其具有发展为侵袭性癌的可能。

在结直肠癌肿瘤发展过程中突变积累的顺序不是随机的。某些基因，如APC和KRAS的突变已被证明会影响早期息肉样病变，而其他遗传事件通常仅在疾病进一步进展时才被观察到，如TP53突变。特定突变与肿瘤发展、组织病理学的特定阶段相关，这种相关性已经成为多年来CRC研究的核心宗旨。

研究结果表明，更多的分子复杂性增强了我们对CRC生物学及其临床管理的理解。CRC的全基因组研究显示，肿瘤中的基因突变数量非常高-每个肿瘤平均有75个左右的突变。在肿瘤之间检测到的异质性非常显着，即使是在疾病的发展中具有关键作用的“驱动基因”，在两个原位CRC之间也很少存在相同的突变。这说明CRC在遗传学角度上高度异质，也表明针对特定分子异常的治疗可能仅在很小一部分患者中有效。

CRC的发展过程已经确定涉及多种不同的组织病理学途径。传统的腺瘤-腺癌途径被认为只占CRCs的50-60％，其他途径，如以多发BRAF突变的锯齿状癌变途径，以及与TP53突变相关的结肠炎途径。了解CRC的各种发展轨迹至关重要，因为不同途径直接影响疾病的临床进展。例如，锯齿状癌变途径的CRC与腺瘤-腺癌途径的CRC相比，对治疗的反应不佳。此外，还有通过微卫星不稳定（MSI）/ CpG岛-甲基化表型（CIMP） 路线发展的肿瘤，这些肿瘤通常位于右侧结肠中，并且在肿瘤转移之前具有较好的预后。

现阶段CRC的治疗标准

早期CRC患者通过使用辅助化疗实现了转归的改善；远端转移的患者的预后也已经通过新的有效的细胞毒性药物和靶向药物以及转移灶的手术切除而得到显着改善。结肠和直肠癌不同的分子性质使两者对辅助化疗的反应不同，相比直肠癌，结肠癌更明显获益于辅助化疗。因此制定治疗方案时肿瘤的位置是需要考虑的重要因素。

早期肿瘤

手术是早期患者的主要治疗方法，手术后的复发率随疾病进展的程度或含有不利特征的增加而增加。辅助化疗可为III期及II期高危患者带来生存获益。目前来看，DNA错配修复（MMR）缺陷状态是唯一可用于选择高风险II期结肠癌患者辅助化疗的生物标志物。而且辅助化疗的疗效存在局限性，在过去十年中，诊断工具，肿瘤样本的病理分析和手术质量有了很大改善，这些改善意味着许多患者可能用辅助化疗过度治疗。实际上，迫切需要重新评估目前的标准和发现更好预测性生物标志物来选择可能受益于辅助化疗的患者。

晚期（转移）肿瘤

在转移CRC患者中，通过系统诱导方案进行术前缩小肿瘤然后进行切除转移瘤可提供最佳的治愈机会，然而，这种选择仅适用于少数患者，因为大多数患者存在更恶性的不可切除的转移。如果切除不是一个可现实的目标，全身治疗（化疗+靶向治疗）大大延长了整体生存期。有效的化疗药包括氟尿嘧啶、伊立替康和奥沙利铂等。化疗可以组合或依次给药，具体取决于患者的特征。通过添加靶向药物可进一步增加化疗的获益，如增加贝伐珠单抗或RAS野生型肿瘤患者可使用西妥昔单抗或帕尼单抗。在过去几年中，除抗EGFR单抗外，其他靶向药物也显示出优于标准治疗的获益，如aflibercept（VEGF-A，VEGF-B和PIGF的诱导受体）、ramucirumab（VEGFR-2抗体）和regorafenib（多激酶抑制剂）。目前RAS突变肿瘤患者的标准一线治疗方案使用化疗（单药，双药或三药）联合贝伐珠单抗。在RAS野生型肿瘤患者中，抗VEGF和抗EGFR哪种方案更佳仍然存在争议。系统治疗策略的选择应取决于肿瘤相关因素（如疾病程度，症状，生物标志物）、患者相关因素（如并发症，社会经济因素，患者期望）和治疗相关因素（如毒性），旨在为患者选择最佳治疗方案。

除了少数的例外，几乎所有的系统治疗都以“一刀切”的方式进行管理，而这其中只有一部分患者可以获益。因此，在mCRC中急需可靠的预测生物标志物，使患者和临床医生能够对化疗和靶向治疗做出更明智的选择，以提高功效和患者的健康状况，并降低不能从治疗中获益的患者的成本。

肿瘤间异质性

肿瘤间异质性是指不同患者亚组中的CRC具有极大差异的遗传组成、组织病理学特征和临床特征。而肿瘤内异质性涉及单个肿瘤内的癌细胞之间的遗传异质性。这些差异可能来自遗传上不同的群体／克隆或各种分化程度的细胞。

早期肿瘤的遗传异质性

多个关于肿瘤解剖学位置与预后关系的研究已证明右侧结肠癌较左侧结肠癌有更差的预后。目前普遍认为左右半肠之间的差异是由于环境和遗传因素共同引起的。

早期结肠癌中提供最多信息的遗传特征无疑是MSI（微卫星不稳定）。 MSI的肿瘤具有受损的MMR系统，并在随后积累了大量的突变。 MSI由MMR基因的突变或MHL1启动子的超甲基化引起。MSI的检测具有重大的临床意义，其主要原因如下：

MSI肿瘤经常发生在Lynch综合征中。MSI状态的确认对患者的遗传咨询是很重要的。

早期MSI肿瘤患者的预后较MSS（微卫星稳定）肿瘤患者好。

II期和III期MSI患者不应用氟嘧啶单药治疗，该治疗已被证实无效，并且影响II期患者的转归。III期MSI肿瘤患者可受益于含有奥沙利铂的辅助治疗。

早期MSI肿瘤患者，使用贝伐单抗联合化疗的辅助治疗手段或可获益。

Sinicrope等人的研究显示，胚系MSI与散发型MSI肿瘤对辅助治疗的响应有差异。胚系MSI的患者在接受5-Fu治疗后DFS高于未接受5-Fu治疗组，但散发型MSI患者中并没有显示相似的结果。

MSI在临床应用中的重要意义已被认可。对于胚系和散发MSI对于化疗疗效不一致的原因，可能是由于在散发MSI肿瘤中BRAF基因的多发突变导致。

在胚系MSI／dMMR结肠癌中不存在BRAF突变，这表明MSI/MMR状态和BRAF突变状态的预后和预测价值的复杂性，表一列出了二者在不同分期患者中的价值。

在未来，将BRAF突变状态与MSI状态同时进行分析，会有助于更好地选择适合辅助治疗的患者。然而这一观测还需要更深入的分析和确认。目前唯一对临床实践中辅助治疗具有预测价值的生物标志物既MSI/dMMR：II期MSI-H患者不应接受辅助化疗；III期MSI患者应选择基于奥沙利铂的辅助化疗，而非氟嘧啶。

“KRAS突变MSS 的III期结肠癌患者预后差，并且具有不同的扩散模式，常伴肺转移。”这些发现支持在未来临床试验中加入这些突变状态并对患者进行分层，I–III期患者仍然缺乏对临床有意义的信息。CDX2表达缺失有望作为高危II期结肠癌辅助化疗反应的预测指标，但预测级别仍较低，结果需进一步确认。早期癌症中其他常见突变，如SMAD4，TP53和APC，与CRC的疾病转归并无显着关系。

肿瘤间异质性——早期肿瘤的转录组学异质性

遗传性变异是肿瘤异质性的基础，但癌症的临床表现和潜在的肿瘤生物学特征是由很多其他的肿瘤特征造成的。如表观遗传差异、基质组份及其与免疫应答的关系等，这些差异均集中在肿瘤转录过程中。市面上已有一些成型的商用检测方案应用于转录组分析，如基于RT-PCR法的Oncotype DX 12-gene (Genomic Health， USA)和基于芯片方法的ColoPrint 18-gene (Agendia Inc.， USA)。尽管这些基因表达的检测方法可用于筛选高复发风险的患者，但对疗效预测方面的价值还需要进一步研究。目前基于转录组分级可将结直肠癌分为四个分子亚型：CMS1-4。（表2）

肿瘤间异质性——转移肿瘤的异质性

1、预后与分子标志物

与早期疾病相似，临床和分子数据都显示mCRC患者具有不同的预后和治疗反应。因预测预后的分子标志物极少，导致“一刀切”的治疗现象，使很多患者承受不必要的昂贵治疗和副作用。KRAS突变状态除了能预测抗EGFR治疗疗效外也具有预后价值。数据表明，解剖学部位（近端、远端）可能是与组织学及BRAF突变状态无关的另一重要预后参数。

2、对化疗响应的影响

全身化疗是mCRC患者治疗的主要方法，尽管对预测化疗疗效的生物标志物进行了深入的研究，但尚无明确的可用于临床的标志物。早期的研究提示ERCC1基因的表达可预测化疗疗效，但在对MAVERICC临床试验的结果初步分析后发现ERCC1表达水平与奥沙利铂的疗效无关。其他治疗性生物标志物正在开发中，但仍没有较成熟的标志物可用于临床。

3、对抗EGFR治疗的影响

（1）正如前文提到的，KRAS突变状态是CRC治疗中最强的预测性生物标志物。最初，携带KRAS 2号外显子突变的肿瘤患者显示对抗EGFR治疗的反应性不佳。随后，发现其他的KRAS（3、4外显子）和NRAS（2、3、4外显子）突变也具有预测价值。因此，目前仅在RAS野生型肿瘤患者中进行抗EGFR治疗。

（2）由于BRAF在MAPK / ERK信号通路中处于RAS的下游，因此预期BRAF突变的癌症与RAS突变的癌症具有相似程度的抗EGFR治疗反应。

值得注意的是，携带BRAF突变的mCRC患者预后极差。BRAF突变（<9％）的低发病率与RAS突变几乎相互排斥，妨碍了该亚组中的前瞻性随机试验的可行性，然而，荟萃分析显示在该亚组中抗EGFR治疗获益非常有限或不获益，因此这些数据不支持在BRAF突变肿瘤患者中使用抗EGFR治疗。

（3）在许多临床前研究中，与抗EGFR治疗疗效相关的分子标志物还包括PIK3CA和继发性EGFR突变。HER2扩增也被确定为抗EGFR治疗耐药的驱动因素。初步临床数据显示，HER2扩增在约5％的KRAS野生型mCRC患者中存在，并且这些患者可能受益于曲妥珠单抗和拉帕替尼的双重HER2抑制。

4、BRAF靶向治疗、免疫治疗与新型治疗

对于BRAF突变患者，目前有十来种不同的联合用药方案在探索，有效率在5%-35%之间；免疫治疗是近年来的热点，在结直肠癌中dMMR／MSI-H的肿瘤对抗PD-1治疗敏感。实际上，目前除了常规的化疗、抗EGFR治疗等，免疫治疗、抗HER2治疗及BRAF抑制剂、MEK抑制剂等针对分子标记物的治疗研究在转移性结直肠癌中逐渐成为热点。每一个分子标志物都有助于识别出更多的预后或治疗亚组，根据基因状态的不同可选择不同的治疗方案，并评估预后和治疗转归，实现结直肠癌的个体化治疗。

肿瘤内异质性

肿瘤内异质性的概念是在过去十年中才逐渐被认可的。肿瘤内异质性是与癌症进展相关的进化过程的结果，在肿瘤发生过程中，共存的克隆数目随着时间的推移而变化，其中包括突变率和选择性压力等因素。而这些克隆具有不同的功能特性，例如能够形成转移或对特定疗法具有响应。

研究发现KRAS和NRAS突变存在于绝大多数的肿瘤细胞中，而BRAF和PIK3CA突变通常仅存在于一小部分癌细胞中。有趣的是，KRAS突变细胞所占比例与西妥昔单抗疗效之间没有直接的关系，数据表明，即使只有少数携带KRAS突变的癌细胞的肿瘤即对抗EGFR药物出现耐药。KRAS突变亚克隆的存在与抗EGFR药物的反应降低有关，携带这些突变的细胞与抗EGFR治疗后复发相关，这一发现已在抗EGFR治疗后复发的CRC患者得到证实。

肿瘤内异质性为精准治疗带来了巨大的挑战，因为如果需预测疗效，不仅需要确定肿瘤中是否存在特异性突变，还要确定其突变频率。

结语

个体化治疗的目标是，可根据每个患者的临床特征、基因组特点等信息来制定治疗方案。但目前预测药物疗效与肿瘤突变特征相关的临床研究有限，除了少数例外，对特定药物的响应绝大多数的差异并不仅仅归因于一个分子靶标。但已经清楚的是，CRC是一种异质性疾病，分子亚型对疾病进展有重大影响，同时也影响不同阶段的治疗选择。总而言之，分子检测有助于我们加深对CRC疾病发展的认识，对CRC的诊疗决策将越来越重要。(世联博研(Bioexcellence)世联博研Bioexcellence）