微流体流通池：片上器官的片外 pH 监测

微流控细胞培养：通往流动细胞的道路

然而，它是一种还原论方法，wu法代表细胞分化、相互作用、组织功能、药物反应以及体内生物学中存在的动态和复杂微环境的内在复杂性（图 1）。这些物理和化学信号对细胞发育和行为至关重要，它们的缺失会导致体外和体内系统之间的转化不良。此外，传统的细胞培养方案既费时又费力]。3这些限制对健康和制药行业产生了深远的影响，导致药物开发过程效率低下且成本越来越高。据估计，大约 40% 进入临床试验的新候选药物由于对人类的不可预见的毒性作用而失败。4缩小临床前和临床数据转换之间的差距需要更好的方法来预测人类反应。

图 1。细胞微环境中的信号图示。化学和温度梯度、细胞间相互作用、来自不同细胞类型的分子信号传导和物理刺激对于细胞发育和行为至关重要，而在传统细胞培养中表现不佳。转载自 Coluccio等人。1

将细胞培养物微型化为微流体系统可以解决一些提到的缺点，还可以提供其他有趣的功能。微流体处理的微量体积大大减少了传统细胞培养所需的试剂量，除了直接降低成本外，这在处理有限或稀有样本时尤其有利，例如患者原代细胞（直接从患者身上收集的细胞到永生化细胞系5）。此外，处理更少量的细胞会降低培养物的异质性，因此更容易区分复杂的细胞行为。微流控器件的易于制造为设计共培养芯片提供了前景，其中可以复制细胞微环境的关键方面，即不同类型细胞的共培养而没有交叉污染，以及物理刺激的复制由于用户控制的流量，具有高时空精度的化学梯度。3连续或按需在细胞上流动的培养基的出现特别令人感兴趣，因为它不仅复制了人体的动态环境，而且还自动化了许多费力的细胞培养实践。这与层流和预定义的通道几何形状提供的高水平控制相结合，利用了目标化合物的精雀添加或微环境的采样，而不会对细胞造成太大破坏。此外，通过并行化多个微流体设备可以实现高通量，其中可以集成并以连续方式执行原位监测和分析。1,3

微流控细胞培养的优势，除了自动监测和分析外，还可以轻松模拟细胞微环境并提供高水平的控制，导致了 2010 年代“芯片上器官”（OoC）领域的发展，目前是微流体研究中zui相关的领域之一。6 OoC 是基于微流体装置的专门体外细胞培养模型，围绕三个主要支柱构建：再现细胞微环境的机械和生化刺激；模拟具有多种细胞类型的组织的 3D 微结构，这些细胞类型放置在特定的通信隔室中；并且，通过复制功能性组织-组织界面细胞间相互作用（图 2.a.）。主要目标是重现复杂的体内生物学，以更好地了解细胞行为和代谢、疾病表型和药物反应，而wu需足够的体外模型或不精雀的动物模型。7

已成功开发了几种器官芯片设备，即肝8、肺7,9、肾10、心脏11,12、肠13、骨14和骨髓15、神经16、血管17,18和血脑屏障19（图 2.b.）。与标准体外模型相比，它们已证明药物反应更接近人体生理学，其复杂性的增强导致更好的细胞分化和药物转运。20随着 OoC 模型的成熟，多个 OoC 在“片上人”方法中的互连变得可行，并且已经由不同配置的几个小组进行了研究。21-24一个有可能深刻改变现代医学的新兴领域是利用源自患者的诱导多能干细胞开发 OoC。这有可能成为个性化医疗和患者特异性治疗发展的范式转变。

图 2。器官芯片系统。一个。专门的器官芯片设备（芯片上的肺）的横截面示意图，突出显示了组织界面和用于机械刺激的真空室。改编自 Huh等人。7 . 湾。不同器官芯片的图示，特别是骨、肝、肠、肺、心脏和肾芯片。

微流体技术使细胞培养的复杂性增加，为对细胞发育和行为进行更深入的时空分析提供了可能性，进一步提高了活细胞成像25、代谢检测和分析26以及微环境监测等工具的重要性。 pH 27等参数。因此，OoCs 中细胞的长期培养从 CO 2培养箱转移到了显微镜阶段。随着系统复杂性的增加和对更详细信息的深入访问，提高系统的分辨率和实时监控成为明确的需求26,28。因此，越来越需要更密切地监测温度、pH 值和溶解的 O如图2所示，随着人们对更好地了解原位代谢活动的兴趣增加，产生了大量的片上和片外传感解决方案。

pH监测的重要性

如前所述，临床前和临床数据之间的差距除了延迟患者获得治疗外，还给卫生部门造成了巨大损失。这一quan球问题的促成因素之一归因于微环境条件的变量。29细胞系需要稳定的 pH 值才能生长，因为酸性 pH 值会不可逆地抑制酶活性以及 DNA、RNA 和蛋白质的合成，从而损害细胞活力。30,31 pH 定义为溶液中游离 H +离子的浓度，也称为质子活度，可以通过 Henderson-Hasselbalch 方程计算：

其中 pk a是酸解离常数；[HB] 是化合物质子化形式的浓度；[B] 是化合物非质子化形式的浓度。

由于动态平衡，缓冲系统能够保持 pH 恒定。缓冲液的质子化和非质子化形式之间的平衡可以朝着与新的游离 H +反应或释放 H +离子的方向发展，以补偿从周围溶液中添加或去除的离子。这两种机制都具有一定程度保持先前游离H +浓度恒定的效果。如果游离 H +的添加或去除超过缓冲液可吸收的阈值，pH 会发生变化，即溶液的缓冲能力超过32. 这就是为什么复杂的生物体，例如哺乳动物，已经开发出动态缓冲系统，可以根据系统的需要调整缓冲液的浓度。生理缓冲系统基于 CO 2 /HCO 3 –的平衡（碳酸氢盐缓冲系统，pk a = 6.15）。肺，通过 CO 2的气体交换和肾脏，通过离子转运蛋白，负责保持该缓冲系统的质子化与非质子化物种的比例处于稳态，以及生物体的 pH 值在生理范围内（图 3.a.）。由于乳酸的产生和释放，细胞代谢必然会酸化微环境的pH值，乳酸与水反应形成酸性乳酸。出于这个原因，细胞培养基通常包含一个缓冲系统，以将 pH 值保持在生理条件下。33除了 CO 2 /HCO 3 –缓冲液，介质可以用非挥发性缓冲液 (NVB) 缓冲，例如 HEPES (4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸) (pKa = 7.3; 37 °C), PIPES (哌嗪-N,N' -bis(2-ethanesulphonic acid);pKa = 6.7) 和 MES (2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid;pKa = 6.0) 34但是，细胞培养基中的 NVB 不在本次审查的范围内，详细可以在 Michl等人，2019年找到有关该主题的工作。 35

借助 CO 2培养箱，在细胞生物学实验室中复制碳酸氢盐缓冲系统。该系统通过培养箱中富含CO 2 的气氛中的 CO 2平衡来工作，CO 2溶解在培养基中并与 H 2 O 反应形成碳酸，以及培养基中存在的 NaHCO 3（图 3.b. ）。细胞培养基含有不同浓度的 NaHCO 3，需要不同百分比的 CO 2。例如，DMEM 带有 44 mM NaHCO 3，这需要大气中大约 10% 的 CO 2才能将 pH 值保持在接近 7.4。二氧化碳2培养箱通常设置为 5% CO 2，使 DMEM 的 pH 值保持在 7.6-7.8 左右。健康细胞产生乳酸和 CO 2以及血清的缓冲能力（通常添加到 DMEM 中）部分抵消了这种差异，允许使用常规 CO 2浓度的 DMEM 细胞生长。35然而，这种调整的影响并没有得到很好的理解。由于跨膜离子转运蛋白，细胞的细胞内 pH 值与微环境的细胞外 pH 值处于密切平衡状态。米歇尔。等。35研究了细胞外 pH 值变化对细胞内 pH 值的影响，并得出结论，细胞根据外部 pH 值重新平衡内部 pH 值。由于大多数 H +目标是细胞内的，因此这种变化会以不可预知的方式影响细胞内机制和代谢途径。

图 3.碳酸氢盐缓冲系统。一个。人体中碳酸氢盐缓冲系统的插图，突出了肺和肾脏提供的平衡。湾。CO 2培养箱的富含 CO 2的气氛中的碳酸氢盐缓冲系统与培养基中存在的盐发生反应。

当培养系统在 OoCs 中缩小到微米范围时，大大减少了体积，pH 的监测变得更加重要。传统细胞培养可以容忍 pH 值的微小变化，例如 7.4±0.3；然而，微流控细胞培养的扩散过程越加强，对细胞活力的影响就越明显，从而促使对关键环境参数进行更密切的监测。

使用流通池监测细胞培养环境

微流控细胞培养中代谢活性的测量通常使用片上解决方案完成。例如，Weltin等人。36在微流控芯片中开发了一种微生理计系统，在培养室内装有溶解的 O 2和 pH 电化学传感器。作者通过在线和连续测量细胞的新陈代谢成功培养了脑癌细胞。然而，当目标是监测细胞培养环境时，这些解决方案被证明过于复杂和昂贵37   ，而这不需要相同级别的详细信息。为此，微流体芯片外解决方案（例如微流体流通池）更适合。可在内部开发微流体流通池38–40，通常是 3D 打印的41或市售的42-46。格式可以根据应用而有所不同，例如用于 HPLC 应用的 T 形接头或适合容纳传感器的其他几何结构（图 4）。主要目标是将传感器与微流体系统保持一致，以实现连续监测。

图 4。细胞培养pH监测。一个。用于 pH 监测的不同流通池示例。前三个可从不同的供应商处购买，弟四个是内部开发和 3D 打印的。湾。带有在线微流体流通池和 pH 传感器的微流体装置示意图。

张等人的工作就是一个很好的例子。47人在内部开发了一个由 pH、O 2和温度传感器组成的“物理传感单元”，用于监测复杂器官芯片系统的微环境。该系统被设计为一个模块化平台，用于控制两个连接到自动流量控制面包板的器官芯片。有趣的是，生物标志物传感单元，即测量新陈代谢的传感器，也在芯片外。该平台通过使用肝脏和心脏器官芯片的药物筛选试验进行验证，暴露于对乙酰氨基酚 5 天和多柔比星 24 小时，其中细胞毒性生物标志物被检测和量化。

法鲁奇等人。26 3-D 打印了一个 pH 传感流通池，以容纳一个光学 pH 传感器，该传感器由市售零件制成，该传感器根据介质中酚红的颜色测量 pH 值。目标是监测一个片上活系统，该系统也旨在研究多柔比星的药物毒性。与对照相比，当细胞暴露于高浓度药物时，研究人员能够检测到 pH 值的降低。同一组对片上肺系统48进行了类似的工作，证明了开发的传感单元的稳健性。Ali等人以类似的方式对成纤维细胞的 pH 和 O 2进行了为期 3 天的监测。49此外，使用介质的酚红，Wu等人。50设计了一个高通量 pH 传感单元，它由平行的微流体通道和一个连接到光学 pH 传感器的传感室组成。他们进行了模拟以定义感应室的zui佳形状，从而形成椭圆形，PDMS 层的厚度也已降低，以zui大限度地减少光传输损失。光学传感器似乎是微流体流通池zui常见的选择，因为它们du立于参比电ji、电气连接和流速。此外，它们不易受到来自介质中分子的电化学信号的生物污染、腐蚀和干扰。49

用于监测的片外流通池 结论和展望

器官芯片技术的重要发展带来了对更密切监控芯片内部发生的情况的需求增加。已经设计了几种片上和片外解决方案，微流体流通池似乎是微环境pH 监测的前进方向。片上传感器适用于检测可受益于高时空分辨率的代谢活动。然而，这些解决方案对于微环境监测来说过于昂贵和复杂，而微环境监测不需要相同的精度水平。对于微环境监测，具有嵌入式光学传感器的微流体流通池，放置在微流体电路中以进行实时和连续监测，是zui常见的选择。